◆產(chǎn)品概要

　　本試劑盒是可以定性分析細(xì)胞培養(yǎng)上清和體液樣品中提取的細(xì)胞外囊泡，以及定量分析si氨酸（PS）特異性結(jié)合的蛋白在固定化的板上與細(xì)胞外囊泡反應(yīng)并固定后，用任意細(xì)胞外囊泡表面標(biāo)記蛋白的小鼠單抗作為檢測(cè)一抗，試劑盒中的HRP標(biāo)記抗小鼠IgG抗體為二抗，可高靈敏度檢測(cè)表面具有任意標(biāo)記蛋白的細(xì)胞外囊泡。

◆特點(diǎn)

采用PS結(jié)合分子Tim4包被板，可高靈敏度定性·定量檢測(cè)培養(yǎng)上清中的細(xì)胞外囊泡

●　通過磷脂酰si氨酸（PS）結(jié)合分子進(jìn)行捕獲。^※1

●　可檢測(cè)出0.1 μL左右培養(yǎng)上清液的細(xì)胞外囊泡。

●　可用純化細(xì)胞外囊泡標(biāo)準(zhǔn)品^※2 定量檢測(cè)。

●　高靈敏度檢測(cè)（檢測(cè)靈敏度可達(dá)WB^※3 的50～1,000倍）。

使用優(yōu)化的試劑組成的試劑盒，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高

●　優(yōu)化對(duì)照用的一抗^※4

●　優(yōu)化檢測(cè)用的二抗^※5

●　采用顯色法

※1 本方法比起使用抗體包被板的ELISA法，可以更好地定性·定量分析細(xì)胞外囊泡。

※2 請(qǐng)使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS純化的細(xì)胞外囊泡標(biāo)準(zhǔn)品。

※3 WB法：免疫印跡實(shí)驗(yàn)

※4 配套抗人CD63抗體。檢測(cè)其他表面標(biāo)記蛋白可使用任意小鼠單抗。

※5 配套抗小鼠IgG抗體-HRP標(biāo)記。

◆試劑盒組成

◆應(yīng)用實(shí)例

從各種細(xì)胞培養(yǎng)上清提取細(xì)胞外囊泡的定性分析

　　將1 ng從各種細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取的細(xì)胞外囊泡添加至孔中，使用能識(shí)別表面標(biāo)記蛋白CD9、CD63、CD81的一抗通過本試劑盒對(duì)各表面標(biāo)記量進(jìn)行定性比較。

　　另外，作為比較參考數(shù)據(jù)，將150 ng從各細(xì)胞培養(yǎng)上清提取的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行電泳，使用能識(shí)別表面標(biāo)記的CD9、CD63、CD81的一抗對(duì)各表面標(biāo)記蛋白量以Western blotting進(jìn)行定性分析。

提取外泌體（1 ng/well）的定性比較數(shù)據(jù)                            　　　　　　　參考比較數(shù)據(jù)

在ELISA系統(tǒng)和WB分析之間，標(biāo)記蛋白的表達(dá)模式具有相關(guān)性。

參考數(shù)據(jù)：各種細(xì)胞的外泌體標(biāo)記蛋白表達(dá)分析

分別使用1 ng各種細(xì)胞的培養(yǎng)上清液來源純化外泌體（使用MagCapture來源外泌體提取試劑盒 PS），外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD63、CD81對(duì)應(yīng)的抗體，進(jìn)行表達(dá)分析。

檢測(cè)抗體

<ELISA>

抗CD9小鼠單抗（M-L13）

抗CD63小鼠單抗（H5C6）

<WB>

抗CD9兔多抗

抗CD63小鼠單抗（8A12）

抗CD81小鼠單抗（1D6）

細(xì)胞株不同，表達(dá)量wan全不同！

有的細(xì)胞株中可能存在對(duì)特定標(biāo)記蛋白的表達(dá)較少的外泌體。

從正常人血清中提取的細(xì)胞外囊泡的定性分析

　　從正常人血清的6個(gè)樣品分別提取細(xì)胞外囊泡，通過BCA法算出細(xì)胞外囊泡膜上的蛋白濃度。分別添加40、20、10 ng的細(xì)胞外囊泡到孔中，用可識(shí)別表面標(biāo)記CD63的對(duì)照組檢測(cè)一抗（試劑盒配套）對(duì)檢測(cè)的OD值進(jìn)行定性比較。

提取外泌體（1 ng/well）的定性比較數(shù)據(jù)

即使是從體液樣品中純化的細(xì)胞外囊泡也具有良好的線性

從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取的細(xì)胞外囊泡的檢測(cè)靈敏度的參考數(shù)據(jù)

　　從COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取細(xì)胞外囊泡，比較本試劑盒和免疫印跡的檢測(cè)靈敏度。

Western blot和ELISA的檢測(cè)靈敏度比較

圖（a），（b）為使用各種抗CD63抗體（其他公司產(chǎn)品，F(xiàn)UJIFILM Wako產(chǎn)品： 012-27063）進(jìn)行免疫印跡的檢測(cè)靈敏度數(shù)據(jù)

樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清提取細(xì)胞外囊泡（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS提取）

★：各抗體中免疫印跡的檢測(cè)上限。

圖（c）Exosome ELISA Kit檢測(cè)上限數(shù)據(jù)

　　使用本試劑盒梯度稀釋COLO201細(xì)胞來源的純化細(xì)胞外囊泡（使用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS）后的樣品以及僅有緩沖液的空白值檢測(cè)并制備COLO201標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線可算出COLO201來源純化樣品的zui低檢測(cè)靈敏度。（按照各濃度點(diǎn)n=6，空白點(diǎn)n=12檢測(cè)）

相比免疫印跡，可以更高靈敏度地檢測(cè)標(biāo)記蛋白。

從細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取細(xì)胞外囊泡的稀釋線性（Linearity）參考數(shù)據(jù)

　　用從COLOC201細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取的細(xì)胞外囊泡作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品的5個(gè)稀釋度（1：100-1：1600）的線性。

COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清

　　標(biāo)準(zhǔn)品：COLO201細(xì)胞來源外泌體

　?。ㄊ褂肕agCapture™ Exosome Isolation Kit PS純化）

　　檢測(cè)樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清

　　一抗：試劑盒配套抗CD63抗體

可以確認(rèn)到良好的稀釋線性以及可檢測(cè)出0.1 μL細(xì)胞外囊泡。  

檢測(cè)不同接種細(xì)胞數(shù)和不同培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)基中的細(xì)胞外囊泡

　　在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷的COLO201細(xì)胞，培養(yǎng)72 h。每24 h回收一部分的培養(yǎng)上清樣品，用PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）和試劑盒配套的Control Primary Antibody Anti CD63 (100×) 進(jìn)行CD63的吸光度檢測(cè)。

　　準(zhǔn)備4 μL的細(xì)胞培養(yǎng)上清，用添加了Exosome Binding Enhancer的反應(yīng)液/清洗液（1×）稀釋至100 μL。

● 檢測(cè)樣品：COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清（25倍稀釋）

● 接種細(xì)胞數(shù)：1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷個(gè)細(xì)胞/瓶

● 培養(yǎng)時(shí)間：24 h、48 h、72 h

● 一抗：抗CD63抗體

　　只需使用4 μL的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，就可直接檢測(cè)細(xì)胞外囊泡量，在討論新型的細(xì)胞株的培養(yǎng)條件時(shí)，省去了討論條件的時(shí)間。

　　可以簡(jiǎn)單方便地討論如何分泌最多的細(xì)胞外囊泡的條件。

添加藥物后引起細(xì)胞外囊泡數(shù)量的變化

　　在T225培養(yǎng)瓶接種K562細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h。之后更換添加終濃度為10 μmol/L的莫能菌素鈉和不含莫能菌素鈉的無血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后回收培養(yǎng)上清樣品，用PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒（抗小鼠IgG POD）和試劑盒配套Control Primary Antibody Anti CD63（100×），檢測(cè)CD63的吸光度。

　　用添加了Exosome Binding Enhancer的反應(yīng)液/清洗液（1×）稀釋回收后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別作為10倍稀釋和100倍稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品。

● 檢測(cè)樣品：K562細(xì)胞培養(yǎng)上清（更換含莫能菌素鈉（產(chǎn)品編號(hào)：ALX-380-026-G001）的培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基后培養(yǎng)24 h）

● 一抗：抗CD63抗體

　　無需提取，少量培養(yǎng)基即可檢測(cè)。

　　可檢測(cè)培養(yǎng)基中外泌體量隨時(shí)間的變化，由于可數(shù)值化外泌體變化量，因此相比WB法更容易進(jìn)行比較。

使用COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清來源和人血清來源純化外泌體比較檢測(cè)靈敏度

　　制備下列①~⑥的樣品，比較用PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒、A公司ELISA試劑盒、A公司ELISA試劑盒（高靈敏型）檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白CD63時(shí)的靈敏度。

使用樣品內(nèi)容

① A公司ELISA試劑盒配套標(biāo)準(zhǔn)品

② A公司ELISA試劑盒（高靈敏型）配套標(biāo)準(zhǔn)品

③ 用MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS提取COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清來源外泌體

④ 用聚合物沉淀法提取COLO201細(xì)胞培養(yǎng)上清來源外泌體

⑤ MagCapture™ 外泌體提取試劑盒PS提取人血清來源外泌體

⑥ 聚合物沉淀法提取人血清來源外泌體

　　PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒相比A公司ELISA試劑盒和A公司ELISA試劑盒（高靈敏型），可更靈敏地檢測(cè)到CD63。另外，A公司ELISA試劑盒和A公司ELISA試劑盒（高靈敏型）對(duì)各自試劑盒配套標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)敏感，但對(duì)PS提取外泌體的反應(yīng)性弱。

　　由此證明，PS Capture™ 外泌體ELISA試劑盒相比公司ELISA試劑盒和A公司ELISA試劑盒（高靈敏型），可以更高特異性且高靈敏性地檢測(cè)外泌體表面的CD63。